聚合酶鏈式反應(聚合酶鏈式反應(PCR)技術原理)

2020-04-03 16:57  閱讀 804 次

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多聚酶鏈反應(PCR)的發展,大力地推動了現代醫學由細胞水平向分子水平、基因水平的發展。由于PCR技術具有快速、簡便、特異、敏感等優點,使該技術廣泛應用于臨床診斷、醫學遺傳學、微生物學等生命科學的各個領域。PCR技術作為一項臨床實驗診斷方法,為臨床疾病的診斷提供更加準確的依據。本文介紹了PCR技術的基本原理,總結了目前國內外的PCR的主要技術發展和類別。
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PCR的定義
PCR(polymerase chain reaction),即聚合酶鏈式反應,這是一種用于在體外擴增特定的DNA片段的分子生物學技術,通過高溫變性、低溫復性和延伸這三個階段不斷循環,將特異片段的基因進行大幅擴增,從而達到將微量的DNA大幅增加的目的,以此來檢測是否有特定基因存在的目的。
PCR的基本工作原理
DNA在體外95℃的高溫時會變性,從雙鏈解旋變成單鏈,為下輪反應做準備:在低溫(經常是60℃左右)時,引物與解開的兩條單鏈按堿基互補配對的原則結合,再調溫度至72℃,在DNA聚合酶的作用下,以dNTP為原料、靶序列為模版,按照堿基互補配對原則和半保留復制原理,沿著磷酸到五碳糖(5‘-3’)的方向合成一條新的與模版DNA鏈互補的半保留復制鏈。
Mg2+濃度對PCR 擴增的特異性和產量有顯著的影響。Mg2+濃度過高,反應特異性降低,出現非特異擴增;而濃度過低會降低TaqDNA 聚合酶的活性,使反應產物減少。
緩沖液能夠提供PCR 反應穩定環境,提高反應體系的抗干擾能力。引物和探針是擴增效率的關鍵。
內標控制系統,內標基因通常是選取與靶基因無相關性的序列設計引物探針,可在VIC/HEX 通道檢測熒光。通過利用全自動熒光PCR 檢測儀檢測上述熒光信號,可以用來檢測反應體系是否正常。
三代PCR技術
第一代PCR技術:
通常我們所說第一代PCR技術就是最初的PCR,采用普通PCR擴增儀來對靶基因進行擴增,然后采用瓊脂糖凝膠電泳對產物進行分析,通過比對條帶的位置做出判斷,只能做定性分析。最初的PCR技術所采用的核酸染料,會對實驗人員和環境造成傷害,而且檢測耗費時間較長,操作麻煩,容易出錯,而且最后的結果只能做出定性的判斷。
其原理是DNA在堿性的溶液中帶有負電荷,因此,在電場作用下朝正極移動。在瓊脂凝膠中電泳時,由于瓊脂糖凝膠具有一定孔徑,長度不同的DNA分子由于所受凝膠的阻遏作用不同,因此導致長度不同的DNA分子的遷移的速度不同,從而可以按照分子量大小得到有效分離。
第二代PCR稱為實時熒光定量PCR技術:
通過在PCR反應體系中加入熒光基團,利用熒光信號累積來實現實時監測整個PCR進程,最后通過標準曲線對未知模板進行定量分析的方法。
利用熒光信號的變化實時檢測PCR擴增反應中每一個循環擴增產物量的變化,通過Ct值和標準曲線的分析對起始模板進行定量分析。
擴增曲線圖:
橫坐標:擴增循環數;
縱坐標:熒光強度
每個循環后都進行一次熒光信號的收集
可以看到PCR的擴增曲線呈現一個S形的曲線
目前qPCR常用熒光標記方法分為兩種:一種是非特異性熒光標記:SYBR Green I,另外一種是特異性熒光標記:TaqMan
SYBR Green I法的方法原理是:當擴增時,單鏈開始擴展延伸,延伸結束,形成雙鏈DNA,SYBR Green將結合到雙螺旋小溝中,當受到適合光源激發,發射出熒光,反映產物濃度。
TaqMan作用機理是:
每擴增一條DNA分子,釋放一個熒光信號,可以在循環過程中任一點檢測熒光。
當探針完整,5′端熒光物質R受3′端淬滅物質Q的制約,不能檢出熒光,而當擴展延伸時,由于與目標序列互補與展開的單鏈結合,R與Q分開,熒光物質此時則游離出來,熒光信號可以被檢出。
第三代PCR技術:
第三代PCR稱為數字PCR,目前分為微陣列芯片式PCR、液滴數字PCR,數字PCR一般包括兩部分內容,即PCR擴增和熒光信號分析。
在PCR擴增階段,與傳統技術不同,數字PCR一般需要將樣品稀釋到單分子水平,并平均分配到幾十至幾萬個單元中進行反應。不同于qPCR對每個循環進行實時熒光測定的方法,數字PCR技術是在擴增結束后對每個反應單元的熒光信號進行采集。最后通過直接計數或者泊松分布公式計算得到樣品的原始濃度或者含量。
微流控芯片數字PCR能夠快速并準確地將樣品流體分成若干個獨立的單元,是進行多步平行反應、成本低、體積小和高通量,是理想的數字PCR平臺。通過芯片設計將納升液體封閉在高通量的微池或微量通道中進行后續的PCR擴增及擴增后結果的熒光顯微鏡進行直接判讀。
液滴數字PCR則是將兩種互不相溶的液體,以其中一種作為連續相(油項),另一種作為分散相(水項),在水/油兩項表面張力和剪切力共同作用下分散相以微小體積單元的形式分散于連續相中,形成液滴,常用作微反應器,具有體積小、樣品間無擴散,反應條件穩定等特點。
利用微滴發生器可以一次生成數萬乃至數百萬個納升甚至皮升級別的單個油包水微滴,作為數字PCR的樣品分散載體。液滴中包裹了單拷貝DNA模板和PCR反應液,將液滴收集在PCR反應管中進行擴增。PCR反應結束后檢測每個微滴的熒光信號。
數字PCR通過稀釋分離使每個反應室含一套擴增體系消除了本底信號的影響,因此檢測結果具有很強特異性和靈敏性,并且通過稀釋分離成幾千至幾百萬個獨立反應單元,再直接計數有擴增產物的個數,可以檢測出極微量的核算模板量,理論上可以檢測出單個拷貝的模板量。
PCR機器的基本構造
目前市面上寵物市場主流產品是第二代PCR,即熒光定量PCR,其基本的工作原理就是對擴增后的產物進行熒光物質的檢測
熒光物質的發光的原理:
通過機器內部發射出短波長的激發光來激發熒光分子,熒光分子受到激發光的照射,會從下部的基態轉變到上部的激發態,激發態的熒光分子就會向外輻射出波長較長的光,通過對熒光分子向外輻射的光進行檢測,就能夠對產物進行定量檢測分析。
目前市面上主流的熒光定量PCR儀器主要構成分為三部分:擴增模塊(溫控系統),熒光檢測模塊(光學系統和檢測系統)和數據分析模塊(軟件系統)
機器內部光源發出的光通過濾光片篩選出需要的激發波長,然后通過光斑整形照射到樣本上,然后樣本激發出熒光,然后再通過另外一塊濾光片篩選出真正的熒光信號,入射到光電探測器上,通過光電探測器實現熒光信號的轉換,轉換出的電信號再進入到數據分析模塊進行分析。
溫控系統:
目前市面用的比較多的是半導體系統,還有一種是空氣熱循環
光學系統:光源:目前市面上主要的是四種,鹵鎢燈(發熱量大壽命短),單色LED(窄光譜),白光LED(寬光譜),激光器(成本高)
探測系統:光電倍增管,光電二極管(逐點掃描),成像相機(同時掃描)
總結
PCR是一種用于在體外擴增特定的DNA片段的分子生物學技術,通過高溫變性、低溫復性和延伸這三個階段不斷循環,從而達到將特異片段的基因進行大幅擴增的目的。
目前PCR技術已經發展到第三代數字PCR,第一代PCR為瓊脂凝膠電泳法,第二代為熒光定量PCR,也是目前寵物市場上的主流PCR。
實時熒光定量PCR儀器是通過在PCR反應體系中加入熒光基團,通過利用熒光信號累積來實現實時監測整個PCR進程,最后通過標準曲線和CT值對未知模板進行定量分析的方法。
目前市面上主流的熒光定量PCR儀器主要構成分為三部分:擴增模塊(溫控系統),熒光檢測模塊(光學系統和檢測系統)和數據分析模塊(軟件系統)
擴增模塊通過精準控制溫度的升高和降低,使核酸分子不斷的循環高溫變性、低溫復性和延伸這三個階段,從而使得特異的基因片段不斷得進行半保留復制,熒光檢測模塊則是通過機器內部光源發出的光,通過濾光片發射出的激發波長照射到樣本上,使熒光分子從基態變為激發態,從而激發出波長較長的光,激發的光入射到光電探測器上,通過光電控制器實現熒光信號到電信號的轉換,轉換出的電信號再進入到數據分析模塊進行定量分析,通過軟件分析出擴增曲線,CT值來進行最后結果的判斷。

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